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酶標記熒光信號放大技術(shù)在IHC中的應(yīng)用
更新時間:2011-11-29   點擊次數(shù):1960次

目前IHC方法可用許多的方法進行檢測,如ABC法、S-P法、CSA法、EnVision法等??捎糜跇擞浀拿赣蠬RP、AKP和葡萄糖氧化酶等。zui后可通過酶促反應(yīng)使其在抗原抗體結(jié)合部位轉(zhuǎn)化為一定顏色的可見沉積物,對抗原進行定位、定量分析。這些轉(zhuǎn)化物可根據(jù)底物不同,產(chǎn)生不同的顏色,如NBT/BCIP為紫藍色,AEC/H202為紅色,DAB/H202為棕褐色等。而另一種酶促反應(yīng)可產(chǎn)生一種能在一定波長光照射下生成各種明亮熒光,使IHC敏感性大大提高。Larison等(1995)較早報道了熒光發(fā)生素—磷酸酶底物(fluorogenic Phosphate sesubstrate)方法,用于IHC的信號檢測放大。該方法將標記在抗體上的堿磷酸催化酶底物,轉(zhuǎn)化成能產(chǎn)生熒光的基團分子。Larison所用磷酸酶底物為2—(5,—氯—2,—羥苯基)—6—氯—4(3H)—喹吡啉,也稱ELF-97磷酸鹽底物,并檢測冰凍切片——石斑魚視黃醛組織內(nèi)的多種抗原成分。其操作流程如下。

(1)常規(guī)石斑魚視黃醛組織冰凍切片16t~m厚,經(jīng)固定,PBS洗。

(2)浸入阻斷液內(nèi)洗30min(阻斷液:30mmol/L Tris鹽、150mmol/L NaCl、1%BSA、0.5%TritonX-IOO,pH7.5)。

(3)滴加適當(dāng)稀釋特異性一抗,37~C,1h,PBS洗3X3min。

(4)生物素化二抗,37~C,30min,PBS洗3X3min。

(5)鏈霉親和素—AKP,37~C,30min,PBS洗3X3min。

(6)熒光信號轉(zhuǎn)化:將切片浸入ELF磷酸鹽底物液[ELF磷酸鹽底物液:將3t~mol/L2—(5,—氯—2,—羥苯基)—6—氯—4(3玎)—喹吡啉加入至底物緩沖液(底物緩沖液:10mmol/LTris、200mmol/LNaCl、lmmol/lMgCl、0.1mmol/lZnCl2和0.1%二甲亞砜)內(nèi)],反應(yīng)8~12s,快速除去反應(yīng)底物,用阻斷緩沖液(阻斷緩沖液:150mmol/LTris、lOOmmol/LED—TA、lmmol/L左旋咪唑、0.05%TritonX—100,pH8.0)洗20min,中止反應(yīng)。

(7)用0.125~mol/LHoechst33342襯染3min,PBS洗,無水甘油封片。熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長為360nm;發(fā)射波長為540nm)。

在熒光顯微鏡下可見ELF底物產(chǎn)生明亮的黃綠色熒光,沉積在抗原抗體結(jié)合部位。Larison等的結(jié)果表明,ELF技術(shù)在IHC中的應(yīng)具有以下特點。

(1)克服組織標本的自發(fā)熒光。ELF—97乙醇沉積物具有180nm以上的Stokes移位,對于組織細胞內(nèi)的自發(fā)熒光位移小的特點,可以有效克服這種缺點。另外,ELF沉積物的熒光信號強度和持續(xù)發(fā)光時間要較其他標記二抗的熒光發(fā)光高500倍,也可以有效地避開自發(fā)熒光的影響。

(2)具有較好的穩(wěn)定性。ELF-97磷酸鹽染色的固定標本可保存數(shù)月或數(shù)年,很少出現(xiàn)熒光信號的損失。

(3)可用于免疫熒光組織化學(xué)的多重標記。ELF產(chǎn)生的亮綠色熒光可與紅色熒光(如Texared、羅丹明、藻紅蛋白)或藍色熒光(例如Hoechst、AMCA和Cascade blue)結(jié)合進行多重標記。

(4)另外,目前分子探針公司已開發(fā)了多種ELF免疫組織化學(xué)染色試劑盒和細胞學(xué)標記試劑盒。商品化試劑盒提供了一種快速、敏感的檢測組織細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和mRNA的方法。
 

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