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炭疽芽孢桿菌A16R株       

       為研究炭疽芽孢桿菌A16R株中的同源整合頻率和機(jī)制，采用不能在鏈霉菌中復(fù)制的大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鏈霉菌Streptomyces lincolnensis B48。質(zhì)粒pYYE04al上攜帶的被硫鏈絲菌素抗性基因滅活的林可霉素生物合成基因與染色體DNA上的同源基因發(fā)生重組，經(jīng)過低抗篩選，得到兩個(gè)突變子S.lincolnensis YY1和S.lincolnensis YY2。進(jìn)一步以硫鏈絲菌素抗性基因?yàn)樘结橂s交染色體DNA smaⅠ片段，S.lincolnensis YY1和S.lincolnensis YY2都得到1.5kb的陽性條帶；而以缺失的lacZ基因?yàn)樘结橂s交染色體DNA成HindⅢ和SmaⅠ聯(lián)合酶切片段，只有S.lincolnensis YY2得到4.4kb的陽性條帶。Suthern雜交結(jié)果表明S.lincolnensis YY1是由同源交換或二次重組產(chǎn)生的，而S.lincolnensis YY2為同源整合的結(jié)果。為驗(yàn)證同源整合子上大腸桿菌復(fù)制子和氨芐抗性基因的存在，用Sph Ⅰ酶切染色體DNA后連接，連接液轉(zhuǎn)化E.coli JM83感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性板上得到2個(gè)轉(zhuǎn)化子，命名為pSLE1。對其進(jìn)行酶切鑒定的結(jié)果表明它是轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pYYE04al的一部分。

       構(gòu)建炭疽芽孢桿菌A16R株eag基因缺失突變株，為研究eag基因的功能奠定了基礎(chǔ)。[方法]本研究以我國人用炭疽桿菌活疫苗A16R株中eag基因?yàn)槟康娜笔Щ?，根?jù)炭疽芽孢桿菌Ames株基因組序列，利用軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增上下游同源臂以及抗性基因引物，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入炭疽桿菌A16R感受態(tài)細(xì)胞中，利用同源重組原理篩選到炭疽桿菌A16R株eag基因缺失突變株。在分子水平及蛋白質(zhì)組學(xué)方面對基因缺失突變株進(jìn)行驗(yàn)證。[結(jié)果]成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，經(jīng)同源重組后獲得eag基因缺失突變株。PCR鑒定表明目的基因已經(jīng)丟失；SDS PAGE表明野生株與突變株在93 kDa處有差異蛋白條帶，經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析該條帶為目的基因所表達(dá)的EA1蛋白；雙向電泳結(jié)果顯示突變株與野生株比較明顯缺失3個(gè)蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析后確定這3個(gè)點(diǎn)都是EA1蛋白。[結(jié)論]成功獲得eag基因缺失突變株，為深入研究eag基因的功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為炭疽芽孢桿菌重要基因功能的研究建立了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)。